March 18th, 2014

Отчёт на кафедре

Дисклеймер: презентация и текст кафедрального отчёта как аспиранта 2 г.о.


1) Глубокоуважаемые коллеги! Данная работа посвящена изучению функциональной роли модификаций рибосомной РНК организма Escherichia coli. [слайд-заголовок]
2) В рибосоме E. coli известно 36 модифицированных нуклеотидов - 11 в малой субчастице и 25 в большой, в большинстве это нуклеотиды, метилированные по азотистому основанию и содержащие в качестве азотистого основания псевдоуридин. На иллюстрации показаны красным цветом метилированные основания, синим - псевдоуридины, зелёным - модификации других типов. Важно расположение модифицированных нуклеотидов - они все расположены вблизи функциональных центров рибосомы. [картинка рибосомы]
3) В данной работе была поставлена цель выяснить функциональную значимость вышеупомянутых модификаций РНК и вообще то, как последовательность мРНК определяет способность к трансляции. Основными рабочими объектами являются нокауты штамма BW-25113 по генам, кодирующим ферменты, вносящие соответствующие модификации в РНК. Нокауты взяты из коллекции нокаутных штаммов Keio, в которой присутствуют практически все целевые штаммы. [таблица генов, вносимых модификаций и что есть в Keio]
4) Поскольку изменения в модификациях, следовательно, в структуре (и в функционировании) рибосомы непосредственно затрагивают аппарат биосинтеза белка - в качестве основного метода изучения была выбрана гель-протеомика: двумерный дифференциальный гель-электрофорез (2D-DIGE). Также для определения изменений в работе рибосомы на конкретных типах матриц и клеточных ответах используются наборы тестовых флуоресцентных репортёрных конструкций. Другими задачами являются поиск фенотипов с помощью измерений кривых роста в разных условиях и количественное измерение экспрессии мРНК генов соответствующих РНК модифицирующих ферментов. [слайд со списком задач и методов]
5) 2D-DIGE основан на последовательном разделении смеси белков (опыта и контроля, меченых красителями с возможностью независимой детекции) сначала по изоэлектрическим точкам в градиенте pH в акриламидной трубке, затем по массам, как в классическом денатурирующем электрофорезе, после выполняется сканирование флуоресценции, визуализация белковых пятен крашением и идентификация различающихся по флуоресценции пятен с помощью масс-спектрометрии. Технически в нашем случае опытом является нокаутный штамм, контролем - дикий тип BW-25113, оба дорощены до одинаковой клеточной плотности, для статистически достоверных оценок эффектов выполняется 3 реплики (1 с инвертированием красителей), крашение выполняется серебром, в качестве метода идентификации используется MALDI после трипсионолиза. [схема двумерки]
6) На данный момент методом 2D-DIGE проанализирована большая часть нокаутных по РНК метилазам штаммов, предварительно сформированы несколько паттернов изменений протеомы, представители из каждой группы приведены на слайде. Идентифицированные на данный момент белки (в большинстве метаболические) пока не позволяют строить предположения о причинах наблюдаемых эффектов. [несколько двумерок с разным паттернами изменений]
7) Флуоресцентные двухрепортёрные конструкции, ранее разработанные в нашей лаборатории, представляют собой плазмиды с двумя генами флуоресцентных белков (CER и RFP), где RFP под неуправляемым промотером и фиксированным 5'-UTRом используется как внутренный контроль, а для аналогичного блока CER заменён либо UTR, либо промотер, либо кодирующая область. Измерение наблюдаемого эффекта вычисляется как соотношение отношения флуоресценций CER к RFP конструкции для изучаемого штамма к соотношению флуоресценции контрольной конструкции (где промотеры и UTRы CER и RFP одинаковые), отклонение в эффекте определяется как отношение вышеописанного отношения к аналогичному отношению, применённому к дикому типу. [схема конструкции и схема расчёта эффектов]
8) Сформирован набор тестовых конструкций на проверку изменений инициирующей способности: разные варианты последовательности Шайна-Дальгарно, серия конструкций на реинициацию и с богатой вторичной структурой в 5'-UTR. В тестовые конструкции включена серия природных UTRов для детекции эффектов специфической регуляции трансляции, природных промотеров для детекции специфических транскрипционных регуляторных сигналов и ряд конструкций с фрагментом кодирующей области из других генов для детектирования отклонения эффектов от кодирующей области. [список типов конструкций]
9) Технически методика полуавтоматизированной трансформации и высевания с измерением флуоресценции ещё в стадии доработки, поскольку ранний вариант дал не надёжные результаты, но принцип состит в следующем: компетентные клетки нокаутного штамма трансформируются набором плазмид в плашечном формате, после фенотипической эксперссии клетки переносятся на агар, после получения колоний выполняется инокуляция малого объёма среды с 4 репликами, после инкубации выполняется плашечное измерение флуоресценции. [схема методики]
10) В нашей лаборатории в рамках других проектов нами были отработаны способы получения флуоресцентных конструкций с рандомизированными и мутированными элементами - 5'-UTR и кодирующей областью. Такие библиотеки служат мощным источником как новых тестовых конструкций для определения роли модификаций рРНК в трансляции, так и данных по трансляционным способностям - что даёт возможность строить предикативную модель силы инициации трансляции. На слайде приведены созданные на данный момент библиотеки [слайд со схемами конструкций].
11) Клетки после трансформации библиотекой таких плазмид инкубировались и подвергались клеточной сортировке на 6-8 фракций по разным соотношениям интенсивностей CER к RFP, после чего выполнялась амлификация рандомизированного участка плазмиды и ампликоны отправлялись на полупроводниковое секвенирование [схема нашего упрощенного FlowSeq с картинкой с сортера].
12) Из данных глубокого секвенирования мы с помощью собственных алгоритмических инструментов получали информацию о частоте встречаемости каждого обнаруженного варианта рандомизированного фрагмента в каждой фракции, из которой в приближении о гауссовом распределении по фракциям можно вычислять относительное, в рамках одного эксперимента, значение трансляционной способности для каждого варианта [схема с ходом обработки ридов и вычисления InAb].
13) Статистика результатов обработки данных приведена на слайде. Примечательно что нам удалось полностью охватить все возможные варианты в случае рандомизации 4 нуклеотидов [таблица-саммари с числами о ридах и вариантах каждой фракции].
14) Поскольку на данный момент нет готового инструментария подробного анализа таких наборов данных, ведётся активная его разработка. Общие оценки эффектов согласуются с классическими представлениями об факторах, определяющих инициацию трансляции. Примечательно что удалось обнаружить случаи высокоэффективной инициации трансляции для UTR, не содержащих Шайна-Дальгарно [слайд со статистическими корреляциями эффектов на InAb].
15) Таким образом, используя в данной работе подходы "сверху вниз" - от белков к РНК, в случае гель-протеомики и "снизу вверх" - от РНК к белкам, в случае репортёрных конструкций, мы выясняем функциональную роль модификаций рибосомной РНК и строим предсказательную модель для инициации трансляции [слайд-картинка с вышеназванным].
16) На данный момент по теме работы опубликована одна статья, две другие работы за пределами этого проекта ещё находятся в печати [заголовок статьи в NAR, будущие 2 мелкие статьи не по теме серым].
17) Проект предикативной модели для 5'-UTR был представлен на 1 международной и 1 российской конференции.
18) Также выполнена 1 курсовая, 2 за этот год в работе, ещё 1 за следующий и также в процессе 1 дипломная работа. Спасибо за внимание, какие вопросы? [список курсовых]