December 9th, 2013

МОСТ - Микро-Оптическая Секционная Томография

Дисклеймер: этот пост является очень сжатым обзором для кафедрального Journal Club серии статей китайского коллектива нейробиологов.

Micro-Optical Sectioning Tomography to Obtain a High-Resolution Atlas of the Mouse Brain

Абстракт:
The neuroanatomical architecture is considered to be the basis for understanding brain function and dysfunction. However, existing imaging tools have limitations for brainwide mapping of neural circuits at a mesoscale level. We developed a micro-optical sectioning tomography (MOST) system that can provide micrometer-scale tomography of a centimeter-sized whole mouse brain. Using MOST, we obtained a three-dimensional structural data set of a Golgi-stained whole mouse brain at the neurite level. The morphology and spatial locations of neurons and traces of neurites could be clearly distinguished.

Цитата из начала статьи:
One of the most important aims in neuroscience is to obtain an interconnection diagram of the whole brain. In mammals, individual neurons are considered the basic units of the brain, but the complex functions of the brain depend more on the fine anatomical architecture of a very large number of neurons and their connections. Although modern neuroscience has made great progress in brain studies at both the system and cellular levels, our empirical knowledge of neuroanatomical connectivity remains inadequate, limiting the progress of brain studies. Thus, it is necessary to gain new insights into the morphology, localization, and interconnectivity of neural circuits throughout the whole brain at an appropriate resolution. Individual synapses are the finest functional element in circuits, but it is currently not technologically feasible to study the brainwide connectivity of complex vertebrate organisms (e.g., mice) at the synaptic level. In contrast, mesoscale techniques are currently more feasible and applicable for understanding specific neural functions.

Background (не по статье):
Оптические методы являются пороговыми по разрешающей способности для определения структуры нервной ткани - различения отдельных нейронов и связей между ними, хотя высокая производительность для микроскопических методов технически сложна, поскольку "поле зрения" исчисляется микрометрами. Значительно более высокопроизводительные методы нейроимаджинга (MRI и CT), способные за минуты считать структуру всего мозга, обладают значительно меньшим разрешением, не способным ещё различать даже отдельные клетки. Значительно более высокоразрешающая электронная микроскопия, способная в деталях показать структуру органоидов клеток, обладает существенно меньшей производительностью (уменьшенное "поле зрения" по сравнению с оптикой), а техническая специфика пробоподготовки, поддержания электронного микроскопа и его стоимости ещё больше осложняет высокопроизводительное электронно-микроскопическое считывание структуры. Повышение производительности (требуется модификация методики проведения процессов и распараллеливание) проще повышения разрешающей способности (требуется собственно модификация технологии), а производительность оптических микроскопических методов выше, чем электронных - потому была выбрана именно оптическая микроскопия.

По сути:
Оптика способна хорошо работать только с тонкими образцами, гистологические срезы используются уже очень давно, много работ уже было сделано по автоматизации секционной микроскопии. В работе был разработан автоматизированный процесс микро-оптической секционной томографии крашенного и зафиксированного в полимере мозга. Мозг был предварительно окрашен по методу Golgi-Cox (прокрас хроматом ртути - очень длительный протокол), обезвожен и зафиксирован в Spurr resin. Блок полимера с зафиксированным мозгом нарезался на тонкие (1 мкм) узкие (450 мкм) ленты микротомом, ленты на ноже микротома немедленно "считывались" с помощью светлопольного микроскопа с линейным датчиком. Процессинг изображения включал в себя удаление периодического шума, регулярную рекалибровку, нормализацию интенсивности и последующую реконструкцию из срезов. Суммарно процесс занял ~250 часов работы МОСТ-машины, объём сырых данных оценивался в 8 терабайт и результирующий размер вокселя составил 0,33 x 0,33 x 1.0 мкм. Метод считался применимым и для флуоресцентной микроскопии. Далее картинка в псевдоцвете:
MouseBrain-scan

Modified Golgi-Cox method for micrometer scale sectioning of the whole mouse brain

Абстракт:
One of the major challenges of connectomics is obtaining a physical map of the neurons that comprise a circuit and the sites within the whole mouse brain. However, there is no report that addresses the preparation of whole mouse brain tissue for microsectioning. In this paper, such tissue is prepared by a modified Golgi-Cox method in which the staining time is prolonged to half a year, the darkening solution is changed to 1% LiOH, and the brain is embedded in resin. Projections of several coronal sections are reconstructed by serial 1-um sectioning and simultaneous imaging of the specimen. This approach ensures that the stained neurons are present throughout the whole mouse brain from superficial to deep layers and that the neuronal soma and traces of the processes can be distinguished in local magnification.

По сути:
Далее они отработали методику крашения и фиксации для увеличения качества считывания. Это было необходимо, поскольку метод крашения по Golgi-Cox вообще нормально не использовался ранее для массивных образцов (только срезы), к тому-же он имеет ограничения. Изменив стадии фиксации, крашения, осушения и встраивания в полимер они существенно улучшили метод, сделав адаптированную для MOST его версию.

Continuously tracing brain-wide long-distance axonal projections in mice at a one-micron voxel resolution

Абстракт:
Revealing neural circuit mechanisms is critical for understanding brain functions. Significant progress in dissecting neural connections has been made using optical imaging with fluorescence labels, especially in dissecting local connections. However, acquiring and tracing brain-wide, long-distance neural circuits at the neurite level remains a substantial challenge. Here, we describe a whole-brain approach to systematically obtaining continuous neuronal pathways in a fluorescent protein transgenic mouse at a one-micron voxel resolution. This goal is achieved by combining a novel resin-embedding method for maintaining fluorescence, an automated fluorescence micro-optical sectioning tomography system for long-term stable imaging, and a digital reconstruction-registration-annotation pipeline for tracing the axonal pathways in the mouse brain. With the unprecedented ability to image a whole mouse brain at a one-micron voxel resolution, the long-distance pathways were traced minutely and without interruption for the first time. With advancing labeling techniques, our method is believed to open an avenue to exploring both local and long-distance neural circuits that are related to brain functions and brain diseases down to the neurite level.

По сути:
Флуоресцентная микроскопия может дать большее разрешение по сравнению с классической микроскопией на основе рассеяния направленного света, на этом созданы мощные микроскопические методы для изучения биологических объектов, в которых изучаемые компоненты связаны с флуоресцентными белками (получается с помощью методов генетической инженерии). Это даёт бОльшую разрешающую способность, меньший шум и селективную "подсветку". Именно такое для трассировки нейронов в целом мозгу лучше, чем используемые ранее методы химического крашения по Гольджи. Для создания нового метода fMOST - fluorescence micro-optical sectioning tomography (фМОСТ - флуоресцентная микрооптическая секционная томография) они использовали конфокальный флуоресцентный микроскоп с оптико-акустическим дефлектором и детектором на фотоумножителях, получая многоцекционное сканирование в пределах одного среза. Мозги мышей с YFP и GFP фиксировали в полимере по оптимизированному для флуоресцентных белков протоколу, подвергали описанному ранее секционному сканированию (но с другим микроскопом), пре-процессинг, нормализация и сбора выполнялись по сходным с MOST алгоритмам. Для трассировки нейронов использовался набор данных на MRI и FPMA (Franklin and Paxinos Mouse Atlas). Картинка трассировки:
MouseBrain-FluorScan

Automated and Accurate Detection of Soma Location and Surface Morphology in Large-Scale 3D Neuron Images

Абстракт:
Automated and accurate localization and morphometry of somas in 3D neuron images is essential for quantitative studies of neural networks in the brain. However, previous methods are limited in obtaining the location and surface morphology of somas with variable size and uneven staining in large-scale 3D neuron images. In this work, we proposed a method for automated soma locating in large-scale 3D neuron images that contain relatively sparse soma distributions. This method involves three steps: (i) deblocking the image with overlap between adjacent sub-stacks; (ii) locating the somas in each small sub-stack using multi-scale morphological close and adaptive thresholds; and (iii) fusion of the repeatedly located somas in all sub-stacks. We also describe a new method for the accurate detection of the surface morphology of somas containing hollowness; this was achieved by improving the classical Rayburst Sampling with a new gradient-based criteria. Three 3D neuron image stacks of different sizes were used to quantitatively validate our methods. For the soma localization algorithm, the average recall and precision were greater than 93% and 96%, respectively. For the soma surface detection algorithm, the overlap of the volumes created by automatic detection of soma surfaces and manually segmenting soma volumes was more than 84% for 89% of all correctly detected somas. Our method for locating somas can reveal the soma distributions in large-scale neural networks more efficiently. The method for soma surface detection will serve as a valuable tool for systematic studies of neuron types based on neuron structure.

По сути:
В исследованиях структур больших объектов неизбежно всплывает задача автоматизации определения элементов структуры, в данном случае был разработан способ компьютерного распознавания тел нейронов в данных MOST. Технически конвейер детекции тел нейронов на изображениях сложен, он базируется на размывании, усилении контраста и сравнении результатов в суб-блоках, не имеет особого смысла излагать технические детали. Картинка результата процесса:
MouseBrain-SomasDetect

Development of a Plastic Embedding Method for Large-Volume and Fluorescent-Protein-Expressing Tissues

Абстракт:
Fluorescent proteins serve as important biomarkers for visualizing both subcellular organelles in living cells and structural and functional details in large-volume tissues or organs. However, current techniques for plastic embedding are limited in their ability to preserve fluorescence while remaining suitable for micro-optical sectioning tomography of large-volume samples. In this study, we quantitatively evaluated the fluorescence preservation and penetration time of several commonly used resins in a Thy1-eYFP-H transgenic whole mouse brain, including glycol methacrylate (GMA), LR White, hydroxypropyl methacrylate (HPMA) and Unicryl. We found that HMPA embedding doubled the eYFP fluorescence intensity but required long durations of incubation for whole brain penetration. GMA, Unicryl and LR White each penetrated the brain rapidly but also led to variable quenching of eYFP fluorescence. Among the fast-penetrating resins, GMA preserved fluorescence better than LR White and Unicryl. We found that we could optimize the GMA formulation by reducing the polymerization temperature, removing 4-methoxyphenol and adjusting the pH of the resin solution to be alkaline. By optimizing the GMA formulation, we increased percentage of eYFP fluorescence preservation in GMA-embedded brains nearly two-fold. These results suggest that modified GMA is suitable for embedding large-volume tissues such as whole mouse brain and provide a novel approach for visualizing brain-wide networks.

По сути:
Для уменьшения потерь флуоресценции, часто имеющей место при фиксации в полимерах, авторы оптимизировали состав смесей реактивов и методику полимеризации. В качестве контроля сравнивали интенсивности нейронов до фиксации и после фиксации на небольшом фрагменте, остальные специфические технические детали не имеет смысла расписывать.