September 10th, 2011

Клеточная биология л2 2011.09.09

ДЕЛЕНИЕ

ЭУКАРИОТИЧЕСКОЙ КЛЕТКИ

Клеточный цикл
- строго одно за другим (универсален для
всех эукариот), за его открытие вручена
Нобелевка в 2002. Исключение - дробление
клетки зиготы на стадии раннего
эмбриогенеза, без изменения объёма.

ФАЗЫ

Митоз (само
деление ядра) и Интерфаза (подготовка
к делению).

Интерфаза - 3
стадии:

картиинка с
прокраской фаз деления: подготовка к
репликации начинается с G1. G1 - gap, промежутки
разделения S (синтез) и M (митоз), где идет
синтез ДНК S и разделение ядра M, G2 - пауза
для накопления белков перед разделением
клеток.

Механизмы
контроля строгого последовательного
цикла:

Системы
циклического контроля и точки остановки
на фазах цикла - сверочные точки,
restriction point, где клетка может очень долго
стоять. Со Старта клетка уже точно
пройдет по циклу до конца.

Как изучали -
эксперименты, где цитоплазму из Метафазных
клеток вводили в обычные и наоборот -
найдены Метафазные факторы, вызывающие
конденсацию хромосом, а в S-фазных есть
факторы деконденсации. Эксперименты,
где был открыт фактор созревания ооцитов.
Эксперименты с дрожжами - удобной
модельной системой, где было показано
на термочуствительных мутантах со
стопором на критической точке деления
- получение синхронизированной по фазе
деления культуры для выделения факторов
продвижения клеточного цикла.

ОСНОВА КОНТРОЛЯ
ЦИКЛА

Ген cdc2 - киназа
в комплексе с циклинами, назвали cdk,
циклин-зависимая киназа, комплекс киназы
и циклинов. Комплекс с G1 циклинами
инициирует выход из G1, а с другими - выход
на М-фазу с иной субстратной специфичностью.
Циклины периодически возникают и быстро
деградируют в соответствии с фазой.
Типы циклинов - A-H, все циклины имеют
гомологичный участок, циклиновый бокс.
2 подсемйства - G1 и митотические. Циклин
А (инициатор М-фазы), всегда имеет
консервативную часть связывания с
киназой и вариабельная часть для
переменной субстратной спецфичности.
На примере дрожжей - в G1 фосфорилирование
инициаторов транскрипции, при M циклинами
идёт фосфорилирование конденсинов и
гистона H1. Cdc киназа активируется и
собственным фосфорилированием, комплекс
с циклином на несколько порядков повышает
активность, фосфорилирование спец.
ферментом CAK еще в сотни раз повышает
активность cdk. Участок связывания АТФ
после фосфорилирования белка повышает
свою эффективность при каталитичнском
процессе.

Есть второе
основание для фосфорилирования -
фермент-выключатель активности — Wee1,
дефосфорилирование второго основания
ещё другим ферментом снова включает
cdk.

Ингибиторы cdk -
CKI, блочат циклинзависимые киназы. 2
группы: общие ингибиторы основной части
и узкоспецифичные для других киназ.

Куда исчезают
циклины - убиваются протеасомами с
помощью убиквитинилирования, быстрого
после инактивирования cdk.

ОБРАТНАЯ СВЯЗЬ

Клетка определяет
закончился или нет полный цикл. На G1
проверяется размер клетки и наличие
повреждений ДНК, на S проверяется полнота
репликации ДНК, на G2 проверка размера
и повреждений ДНК (при прохождении
активируются MPF), на M проверка качества
конденсации хроматина и веретена
деления.

Клеточное
торможение

:

контакты между
клетками - степень распластанности по
поверхности. Чем выше распластанность,
тем выше вероятность инициирования
деления. Регуляция процесса на основе
неспецифического синтеза белка.

На уровне
организма пролифирация упорядочена.
Пример - pRb белок ретинобластомы,
предотвращение черезмерного роста
клетки за счет запрета продвижения по
циклу пока она не готова разделиться.
Подобные домены найдены и в факторах
транскрипции и в p53. Ингибитор определенных
факторов транскрипции.


Молекулярная Биология л3 2011.09.09

ОРГАНИЗАЦИЯ ДНК

В БАКТЕРИЯХ

Мало изучена.
Общие структурные принципы сходны, но
у прокариот всё проще. SMC-аналоговые
белки, удерживающие цепи ДНК между
цепями и внутри. АТФазы также, гидролиз
вызывает сближение удаленных участов
ДНК.

Иерархичность:
связывание разных белков вызывает
разные структурные изменения и образования
структурных единиц между участками и
цепями. SeA - взаимодействует полуметилированным
ориджином. MatP - взаимодействуют со всей
ДНК, вероятно выполняют защитные функции,
похожи на гистоны. и т.д.

Исключение
хромосом из работы за счет взаимодействия
некодирующих РНК, хаотическое вырубание
X хромосом.

РЕПЛИКАЦИЯ

Синтез по матрице.
Все ДНК полимеразы не могут инициировать
синтез - им нужен праймер ДНКовый или
РНКовый, РНК полимеразы могут синтезировать
с нуля.

Вася нарисовал
схему реакции присоединения нуклеотида
на цепи за доп балл, теперь у него 2 доп
балла.

Почти все ДНК
полимеразы имеют коррективную активность
- реплицирующие и репарирующие, могут
гидролизовать не-WK пары.

5 типов полимераз,
3я репликативная, 2 и 1 репарационные, 1
в участвует в обоих процессах, 4 и 5
SOS-ответные без корректирующей способности.
Структуру прочитает отдельно Кочетков.

Степень
процессивности (сколько нуклеотидов
может поставить полимераза без
диссоциации) — репликативная самая
высокая, несколько тысяч, другие — около
сотен. Высокая процессивность
обеспечивается за счет доп. субъединицы.

Нормальные
полимеразы могут достраивать с отрывом
комплементарной цепи разрывы в одной
цепи. Ник-трансляция - выедание разорванной
цепи.

РЕПЛИКАЦИЯ
ПРОКАРИОТ

Отличия эукариот
от прокариот - у прокариот единственный
ориджин репликации, у эукариот
множественные ориджины во многих местах
и в разное время происходит их активация
по мере деконденсации хроматина.

Как правило
двунаправленная репликация, у всех
(иногда однонаправленная, в митохондриях
и хлоропластах, например).

Тетта-структура
- наблюдается при репликации у бактерий.

ИНИЦИАЦИЯ:
специфическая последовательность
ориджина и куча АТ богатых участков.
Связывается ATP-DnaA, от АТФ меняет конформацию
с изменением сродства к 1 и 2 цепочечным
ДНК, измененный DnaA полимеризуется со
своим гомологом и разворачивает цепь
И идёт повышение сверхспирализации
ДНК, она нужна для облегчения проходов
полимераз и проверки на разрывы ДНК.

РЕПЛИКАЦИЯ:
После связывания и разворачивания на
место начала репликативной вилки садится
ДНК-геликаза, DnaB-хеликаза, но она сама
сесть не может без фактора - DnaC фактора
для ее работы. Затем садится DnaJ - праймаза,
делает праймер для полимеразы 3. Для
защиты одноцепочечной ДНК при развертке
связывается SSB(protein). Для продолжения
синтеза на цепь навешивается бетта-clamp.
Лидирующая цепь, по которой идет
полимераза следом за хеликазой, а вторая
цепь - запаздывающая, на которой постоянно
переинициируется РНК-праймерами синтез
ДНК. Полимеразы взаимодействуют друг
с другом, координнируя работу за счет
специальной субъединицы, потому петля
разницы лидирующей и отстающей ограничена
по размеру, регулярно выполняется
переинициация синтеза на отстающей
цепи и-за периодической диссоциации
репликативного комплекса на ней.
Цепи-куски на запаздывающей цепи -
называются фрагменты Оказаки.

УДАЛЕНИЕ ЗАТРАВКИ:
РНКаза H гидролизует затравку, после
чего брешь в цепи достраивается любой
из 3х полимераз, но как правило полимеразой
1, хотя она за счет РНКазной активности
может и съесть РНК сама, достроив цепь
просто до ДНК цепи ником.

ДНК топоизомераза
снимают положительные супервитки,
гираза накручивает отрицательные
супервитки.

Геликазы -
работают на изменении сродства к
двухцепочечной и одноцепочечной ДНК
из-за изменения конформации субъединиц
из за связывания АТФ и АДФ. Ожидание
перехода в открытую форму ДНК и продвижение
из за разных конформаций по принципу
броуновской машины.

SSB как эукариотический
аналог RPA - гомотетрамер с положительной
кооперативностью и возможностью
полимеризации на одноцепочечной цепи.

Почему добавление
нуклеотидов только с 3' конца ? - для
однозначности и обеспечения корректирующей
возможности, т.к. активная группа на
мономере, а не полимере.

Бетта-clamp садится
за полимразой, взаимодействует с ней,
удерживает и не дает отвалиться.
Гамма-комплекс - АТФ зависимая навешивалка
бетта-клэмпа на ДНК, он открывает клэмп,
тот надевается на ДНК и закрывает клэмп
с гидролизом АТФ и уходом самого
гамма-комплекса. У эукариот немного
более сложная система с дополнительными
возможностями регуляции процесса.

ДНК лигазы -
сшивают цепи с переносом АМФ за счет
АТФ и NAD

Топоизомеразы
- 1 и 2 классов. 1 класса вносят разрыв в
1 цепь, она оборачивается и сшивася. 2
класса вносят двуцепочечные разрывы,
обычно нужны для репликации. 2е могут и
накручивать витки, нужны для структурной
организации. 1е подкласса А сначала
переносят ковалентно на одну из цепь
тирозин, вторая цепь взаимодействует
с белком. подкласс В работает с поворотом,
а не протаскиванием вовнутрь. 2 класса
АТФ зависимые, состоят из многих доменов,
протаскивают вторую двуцепочечную цепь
через синхронный разрыв с помощью "лап".
Отпуск второй цепи происходит после
лигирования первой цепи. Работает только
в случае близости двух ДНКовых цепей
для возможности одновременного связывания
и протаскивания. Могут сделать или
разрешить катенановую структуру и
снимать перепутывание с напряжением,
особенно при репликации.

Сбой топоизомераз
2 типа крайне опасен, репарация
двуцепочечных разрывов крайне трудна,
а при расхождении концов невозможна,
если нет возможности для гомологичной
рекомбинации.

ТЕРМИНАЦИЯ

Специфические
последовательности для белков
терминаторов, на них репликативная
вилка разбирается и недочитанный кусок
дочитывается системой починки.
Переплетение цепей разрешается
топоизомеразами 2 класса и гомологической
рекомбинацией.